期刊简介
本刊刊登基础医学、预防医学与相关的科技新理念、新成果、新技术等研究论文和医学管理方面论文。
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首页>中国现代医学杂志
- 杂志名称：中国现代医学杂志
- 主管单位：中华人民共和国教育部
- 主办单位：中南大学,中南大学肝胆肠外科研究中心
- 国际刊号：1005-8982
- 国内刊号：43-1225/R
- 出版周期：旬刊
期刊荣誉：2000年、2002年二次被省科技厅、省新闻出版局评为一级期刊期刊收录：CSCD 中国科学引文数据库来源期刊(含扩展版), 维普收录(中), 万方收录(中), 哥白尼索引(波兰), 国家图书馆馆藏, CA 化学文摘(美), 北大核心期刊(中国人文社会科学核心期刊), 知网收录(中), 上海图书馆馆藏, 统计源核心期刊(中国科技论文核心期刊)
微囊化和基因修饰的肝细胞移植--人肝再生增强因子(hALR)的原核表达、纯化及生物活性研究
张阳德；赵劲风；杨林；刘晓冬；陈伟
关键词：人肝再生增强因子, 基因重组, 融合蛋白, 转化, 纯化, 生物活性, 诱导表达
摘要：目的:构建人肝再生增强因子原核融合表达载体,并对表达产物进行生物活性研究,从而为hALR基因修饰的肝细胞移植的细胞来源研究提供实验依据,并为人肝再生增强因子的临床应用奠定基础.方法:以pGEM-T-hALR为模板,应用PCR技术扩增出hALRcDNA,克隆入原核融合表达载体pGEX-4T-2,限制性内切酶酶切及测序证实序列正确;转化大肠杆菌JM109:挑取阳性克隆以IPTG诱导表达融合蛋白GST-hALR,融合蛋白通过谷胱甘肽Sepharose 4B亲和层析纯化后进行凝血酶酶切获得hALR单体;采用3H-thymidine渗入法检测hALR单体的生物学活性.结果:以pGEM-T-hALR为模板,行PCR扩增后,产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳分析,可见380bp特异性条带,符合hALRcDNA阅读框架的大小.构建融合蛋白GST-hALR的重组表达质粒pGEX-4T-2-hALR,经限制性内切酶酶切分析,与理论值相符,测序证明序列正确,片段为正向插入.重组表达质粒转化人肠杆菌JM109.SDS-PAGE电泳分析显示重组菌在约41KD处出现一蛋白条带.纯化、酶切后融合蛋白前体谷胱甘肽S-转移酶约26KD,hALR约15KD.薄层扫描蛋白电泳结果表明,表达的融合蛋白占细菌可溶性蛋白总量的31%.纯化hALR加入原代鼠肝细胞、HepG2细胞培基,细胞DNA合成率较对照组均有显著提高(P＜0.01).结论:成功构建融合蛋白GST-hALR的重组表达质粒pGEX-4T-2-hALR,限制性内切酶酶切及序列测定证明载体插入正确,并成功转化大肠杆菌JM109得阳性克隆.采用含融合蛋白GST的原核表达载体pGEX-4T-2表达hALR,其突出优点在于表达产率高;重组蛋白主要以可溶形式存在于胞质中,融合蛋白的分离纯化筛单易行.纯化分离后所得hALR能刺激体外培养的原代鼠肝细胞、HepG2细胞DNA合成,具有生物活性.
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